1. Многоцветный анализ – основные
принципы и подходы
Кудрявцев Игорь Владимирович*
igorek1981@yandex.ru
Савицкий Валерий Павлович**
vsavitski@beckman.com
* отдел иммунологии, ФГБУ «НИИ экспериментальной медицины» СЗО РАМН,
Санкт-Петербург;
кафедра цитологии и гистологии, Санкт-Петербургский государственный
университет;
школа биомедицины, Дальневосточный федеральный университет, Владивосток
** ООО "Бекмен Культер", Москва
Пушкинские годы, 27 января – 2 февраля 2013 г.
2. Для чего нужен многоцветный анализ?
• Оптимален и необходим для онкогематологии –
типирование лейкозов и лимфом
• Повышает информативности
иммунологических исследований:
– большее число комбинаций
– большее число Ag определяется на одной
клетке
– детальная характеристика фенотипа
отдельных клеточных популяций
– анализ как основных, так и малых
популяций по широкому спектру маркеров
•Увеличивает информативность научных
исследований
•Меньше пробирок в панели – экономия времени,
трудозатрат и сопутствующих реагентов!
•Большая пропускная способность проточного
цитометра, экономия «ресурса» прибора
3. Флуорохромы для многоцветного анализа
В настоящее время – более 40 различных флуорохромов; однако
одновременно можно использовать не более 18 флуорохромов даже на
самых «продвинутых» приборах.
5. Новые флуорохромы -
новые требования к подготовке образцов
- работа с антителами должно проводиться в отсутствие прямого
солнечного света;
- инкубация образцов с антителами темноте;
- хранение готовых проб в защищенном от света месте и на холоду
(+4°С); Инкубация в темноте
Инкубация на свету, 15 минут
6. Новые флуорохромы -
новые требования к подготовке образцов
- использование готовых смесей антител;
- самостоятельная подготовка «коктейлей» антител перед окраской образцов;
- тандемные красители следует вносить в смесь последними, чтобы
минимизировать их облучение светом;
Все это позволяет:
600
- упростить работу с реагентами;
- сократить время подготовки
проб;
400 533
- снизить вероятность ошибок
при внесении антител!!!
200
Подготовка для анализа 5
пробирок, в каждой – 5
142 антител, конъюгированных с
5 различными
0 флуорохромами
Одноцветные Пятицветные
реагенты панели
7. Итак, 3 лазера и 10 каналов для детекции 10
флуорохромов одновременно…
… КОМПЕНСАЦИЯ!!! APC or AF647
APC or AF647 APC-AF700
APC-AF700 APCCy7 or APC-AF750
APCCy7 or APC-AF750
635nm
FITC
FITC PE
PE ECD
ECD PECy5.5
PECy5.5 PECy7
PECy7
488nm
Pacific Blue
Pacific Blue Krome Orange
Krome Orange
405nm
400 500 600 700 800
8. Вариант №1.
Минимизировать компенсацию - использовать антитела с
флуорохромами, спектры которых слабо перекрываются
Pac Kr FITC PE ECD PC5.5 PC7 APC APC APC
Blue Orange AF700 AF750
CD25 CD3 CD8 - - CD4 CD3 CD45 - -
12. Многоцветная компенсация – некоторые
частные вопросы:
Расположение маркеров по каналам:
- для пан-лейкоцитарных, линейных и «ярких» маркеров
используйте фиолетовый лазер;
- для маркеров «популяций интереса» - красный лазер;
- маркеры активации и «маркеры интереса» ставьте на голубой
лазер.
Применяйте тандемные красители с тем расчетом, что тандемы,
содержащие Cy5 / Cy5.5 / Cy7, возбуждаются голубым и красным
лазерами, следовательно, помещайте маркеры со среднем
уровнем экспрессии, а также маркеры малых популяций на
голубой лазер.
Для субпопуляционных/взаимоисключающих маркеров можно
использовать пары: ECD - PC5.5, PC5 - APC, PC5.5 – APCA700,
PC7 - APCA750 или PE - ECD
13. Некоторые рекомендации по подбору
флуорохромов для минимизации многоцветной
компенсации
1. Для детекции антигенов с низким уровнем экспрессии
следует использовать яркие флуорохромы, антигены с
высоким уровнем экспрессии одинаково хорошо работают со
всеми красителями
2. Для исследования слабо представленных антигенов НЕ
следует использовать соседние – «соприкасающиеся»,
перекрывающиеся - каналы, на которых располагаются
антигенами с высоким уровнем экспрессии
3. Разрешается, но не рекомендуется, использовать «соседние»
каналы для ярких «неперекрывающихся» -
взаимоисключающих антигенов
4. Не рекомендуется использовать соседние каналы для
коэкспрессирующихся антигенов
5. Допускается применение субпопуляционных маркеров на
каналах, сильно «засвечивающих» основные маркеры, НО не
наоборот
14. 1. Для детекции антигенов с низким уровнем
экспрессии следует использовать яркие
флуорохромы…
CD25-PE CD25-PC7
CD56-PE P-AKT s473 Alexa 647
15. … антигены с высоким уровнем экспрессии
одинаково хорошо работают со всеми
красителями.
FITC PE ECD PC5 PECy5.5 PC7
APC Alexa 700 APCAlexa 700 APC-H7 APCAlexa 750
Pacific Blue Pacific Orange
CD8
16. 2. Для исследования слабо представленных антигенов НЕ
следует использовать соседние – «соприкасающиеся»,
перекрывающиеся - каналы с антигенами с высоким уровнем
экспрессии
HLA-DR-PE –
является ли это
оптимальным
выбором?
(CD45 берем по FITC)
17. 2. Для исследования слабо представленных антигенов НЕ
следует использовать соседние – «соприкасающиеся»,
перекрывающиеся - каналы с антигенами с высоким уровнем
экспрессии
CD45, конъюгирован с
Pacific Blue.
HLA-DR-FITC
разрешение гораздо
лучше, чем при
использовании HLA-
DR-PE
18. 3. Разрешается, но не рекомендуется, использовать
«соседние» каналы для ярких неперекрывающихся
антигенов
CD4-APC
CD20-APCAF700
CD8-APCAF750
CD4-PacBlue
CD20-ECD
CD8-APCAF700
M utually excluding antigens serve each other as dump channels
19. 4. Не рекомендуется использовать соседние каналы
для ко-экспрессирующихся антигенов
PC5,5 на ECD – до 45%
ECD на PC5,5 – до 4%
PE/APCAF750 и
APCAF750/PE –
менее 0,5%
20. 5. Допускается применение субпопуляционных
маркеров на каналах, сильно «засвечивающих»
основные маркеры, НО не наоборот
21. Настройка прибора при многоцветном анализе
• Настройка напряжения. Для настройки напряжения используйте
соответствующие изотипические контроли или образцы, окрашенные
антителами по отдельности.
• Компенсация. Для настройки:
– используйте CD45, конъюгированные с различными
флуорохромами для автоматической настройки компенсации;
– используйте образны, окрашенные каждым из антител по
отдельности;
– для проверки правильности настройки компенсации используйте
FMO-подход (fluorescence-minus-one);
при переходе на другой лот антител проверяйте компенсацию!
Процедуру настройки рекомендуется проводить с использованием всех
перечисленных выше подходов. После настройки и проверки –
НИЧЕГО НЕ МЕНЯЙТЕ!!!!
23. Для корректного сбора данных необходимы следующие
гистограммы:
-FS vs. SS – выделение популяций
лимфоцитов, моноцитов
и гранулоцитов (гистограмма “Ungated”
- отображены все популяции лейкоцитов)
-CD45 vs. SS – выделение
популяции лимфоцитов
(гистограмма “Ungated” –
отображены все популяции
лейкоцитов)
24. Для корректного сбора данных необходимы следующие
гистограммы:
- двухпараметрические гистограммы «флуоресценция vs. SS» – контроль
корректности выставленного напряжения по каждому из каналов
флуоресценции (все гистограммы “Ungated” – все популяции лейкоцитов)
25. Для корректного сбора данных необходимы следующие
гистограммы:
-CD45 vs. SS и FS vs. SS –
выделение популяции лимфоцитов;
удаление из зоны анализа
разрушенных и слипшихся клеток
При анализе «редких» популяций клеток также рекомендуется удалять из зоны
анализа дуплеты клеток (соотношение пикового и интегрального сигналов,
например) и использовать по одному из каналов флуоресценции какой-либо
краситель для определения жизнеспособности клеток (например, кальцин по FL1
или 7-AAD по FL4)
26. Для корректного сбора данных необходимы следующие
гистограммы:
- двухпараметрические гистограммы «флуоресценция-против-
флуоресценции» - контроль корректности настройки компенсации (на всех
гистограммах отображены ТОЛЬКО клетки интереса!!!)
27. T/B/NK, маркеры «ранней» и «поздней» активации
8-цветная комбинация
Цель исследования:
Выделить популяции B-лимфоцитов, NK- и NKT-клетки, а также CD4+ and CD8+ Т-клетки
Оценить уровень экспрессии активационных маркеров на примере CD25 и HLA-DR
Расположение антител по каналам:
488 Excitation 633 Excitation
FITC PE ECD PC5.5 PC7 APC APC-A700 APC-A750
HLA-DR CD4 CD3 CD56 CD25 CD8 CD19 CD45
IM1638U A07751 A07748 A79388 A52882 IM2469 A78837 A79392
Материал: - периферическая кровь
Пробоподготовка: - лизис эритроцитов при помощи VersaLyse (A09777) + IOTest 3
Fixative (A07799), без отмывки, внесение по завершении лизиса эритроцитов
чаcтиц Flow-Count (7547053) для абсолютного счета.
Сбор данных – NaviosTM
(2 лазера, 8 цветов), обработка данных - KaluzaTM
32. T/B/NK, популяции наивных клеток и клеток памяти,
уровень экспрессии CD38 (8-цветная комбинация)
Цель исследования:
Выделить популяции B-лимфоцитов, NK- и NKT-клетки, а также CD4+ and CD8+ Т-клетки
Среди популяций Т-хелперов и цитотоксический Т-клеток выделить популяции наивных клеток,
центральных и эффекторных клеток памяти, а также «терминально-дифференцированных»
эффекторных клеток.
Определить уровень экспрессии активационного маркера CD38 на всех перечисленных выше
популяциях клеток
Расположение антител по каналам:
488 Excitation 633 Excitation
FITC PE ECD PC5.5 PC7 APC APC-A700 APC-A750
CD38 CD62L CD45R0 CD56 CD3 CD4 CD19 CD8
A07778 IM2214U IM2712U A79388 737657 IM2468 A78837 A94683
Материал: - периферическая кровь
Пробоподготовка: - лизис эритроцитов при помощи VersaLyse (A09777) + IOTest 3
Fixative (A07799), без отмывки, внесение по завершении лизиса эритроцитов
чаcтиц Flow-Count (7547053) для абсолютного счета.
Сбор данных – NaviosTM
(2 лазера, 8 цветов), обработка данных - KaluzaTM
